Detección de agentes virales diarreagénicos en niños menores de cinco años en Bucaramanga y su área metropolitana
Acute diarrheal disease (ADD), the highest prevalence in children under five. It can be caused by bacteria, parasites and / or viruses mainly. The diagnosis of gastrointestinal viral infections is limited by the high costs of molecular techniques and the lack of health personnel about its clinical i...
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| Institution: | Universidad EIA |
|---|---|
| Main Authors: | , , |
| Format: | Trabajo de grado - Maestría |
| Language: | Español |
| Published: |
Bucaramanga : Universidad de Santander, 2016
2016-10-21
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| Subjects: | |
| Online Access: | https://repositorio.udes.edu.co/handle/001/634 |
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Sánchez Álvarez, Nayibe T. Farfán García, Ana Elvira Gómez Duarte, Oscar Gilberto 2018-11-22T22:56:49Z 2018-11-22T22:56:49Z 2016-10-21 135 p. Cd Acute diarrheal disease (ADD), the highest prevalence in children under five. It can be caused by bacteria, parasites and / or viruses mainly. The diagnosis of gastrointestinal viral infections is limited by the high costs of molecular techniques and the lack of health personnel about its clinical importance. Reported studies of these infections in Colombia are scarce. Objective: To identify the frequency of viral agents associated EDA phylogenetic level and characterize the two most common viral agents. Materials and Methods: From biological material collected from a previous case-control study of 405 children with EDA and 405 controls, an analytical study. Stool samples were processed by molecular methods for the detection of adenovirus, norovirus, sapovirus, astrovirus and rotavirus. Additionally, direct ELISA was used for the detection of rotavirus antigen. Phylogenetic analysis was performed to norovirus and rotavirus by amplifying target gene fragment C region capsid proteins VP4 and VP7 and respectively. Results: Among the 810 samples positive for the virus was detected in 30,1%, 45,4% in cases and 14,8% in controls. The most prevalent virus norovirus GII was 10,9%, followed by rotavirus and sapovirus with 5,1% each. Adenovirus, astrovirus and norovirus GI were detected in percentages ranging from 1,7 to 3,8%. The highest frequency of virus was observed in the age ranges of 12 to 23 months and 24-59 months. GII Norovirus was the most prevalent in cases with symptoms of diarrhea and vomiting in 93 and 88,8% respectively. The most common norovirus genotypes were GI.2 and GII.4 and the most common rotavirus genotypes were G12P8 and G9P8. Conclusions: 6 virus identification was achieved in stool samples of children under five years. The most frequently isolated viral agent was norovirus and most important subtype was norovirus GII. The importance of virus in the epidemiology of EDA and high genetic diversity of genotypes of norovirus and rotavirus in a pediatric population of Bucaramanga and its metropolitan area, Colombia was demonstrated. La enfermedad diarreica aguda (EDA), presenta mayor prevalencia en niños menores de cinco años. Puede estar causada por bacterias, parásitos y/o principalmente virus. El diagnóstico de infecciones virales gastrointestinales es limitado por los altos costos en técnicas moleculares y el desconocimiento del personal de salud sobre su importancia clínica. Los estudios reportados de estas infecciones en Colombia son escasos. Objetivo: Identificar la frecuencia de agentes virales asociados a EDA y caracterizar a nivel filogenético los dos agentes virales más frecuentes. Materiales y métodos: A partir del material biológico colectado de un estudio previo de casos y controles de 405 niños con EDA y 405 controles, se realizó un estudio analítico. Las muestras de heces se procesaron por métodos moleculares para la detección de adenovirus, norovirus, sapovirus, astrovirus y rotavirus. Adicionalmente, ELISA directo fue usada para la detección de antígenos de rotavirus. El análisis filogenético fue realizado para norovirus y rotavirus mediante la amplificación de genes blanco de los fragmentos de la región C de la cápside y las proteínas VP4 y VP7, respectivamente. Resultados: Entre las 810 muestras se detectó positividad para virus en 30,1 %, 45,4 % en casos y 14,8 % en controles. El virus más prevalente fue norovirus GII 10,9 %, seguido de rotavirus y sapovirus con 5,1 % cada uno. Adenovirus, astrovirus y norovirus GI se detectaron en porcentajes que variaron entre 1,7 y 3,8 %. La mayor frecuencia de virus se observó en los rangos de edad de 12 a 23 meses y de 24 a 59 meses. Norovirus GII fue el más prevalente en los casos con síntomas de diarrea y vómito en 93 y 88,8 % respectivamente. Los genotipos de norovirus más frecuentes fueron GI.2 y GII.4 y los genotipos más frecuentes de rotavirus fueron G12P8 y G9P8. Conclusiones: Se logró la identificación de 6 virus en muestras de materia fecal de niños menores de cinco años. El agente viral más frecuentemente aislado fue norovirus y el subtipo más importante fue norovirus GII. Se demostró la importancia de los virus en la epidemiología de EDA y la alta diversidad genética de los genotipos de norovirus y rotavirus en una población pediátrica de Bucaramanga y su área metropolitana, Colombia. Maestría Magister en Investigación en enfermedades Infecciosas TABLA DE CONTENIDO INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1 1. MARCO TEÓRICO ............................................................................................. 1 1.1 Enfermedad Diarreica Aguda ...................................................................... 1 1.2 Carga de la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) a nivel global ................ 1 1.3 Epidemiología de EDA en Colombia .......................................................... 2 1.4 Agentes causantes de EDA .......................................................................... 5 1.4.1 Norovirus - NoV ........................................................................................ 5 1.4.1.1 Historia ................................................................................................... 5 1.4.1.2 Biología y taxonomía ............................................................................. 5 1.4.1.3 Replicación viral o ciclo biológico ................................................... 7 1.4.1.4 Epidemiología .................................................................................. 8 1.4.1.5 Formas de transmisión ...................................................................... 9 1.4.1.6 Aspectos clínicos y complicaciones ....................................................... 9 1.4.2 Rotavirus .................................................................................................. 10 1.4.2.1 Historia ................................................................................................. 10 1.4.2.2 Biología y taxonomía .......................................................................... 10 1.4.2.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 11 1.4.2.4 Epidemiología ...................................................................................... 12 1.4.2.5 Formas de transmisión ......................................................................... 13 1.4.2.6 Aspectos clínicos y complicaciones ..................................................... 13 1.4.3 Sapovirus ................................................................................................. 13 1.4.3.1 Historia ................................................................................................. 13 1.4.3.2 Biología y taxonomía ........................................................................... 13 1.4.3.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 14 1.4.3.4 Epidemiología ...................................................................................... 14 1.4.3.5 Formas de transmisión .................................................................... 15 1.4.3.6 Aspectos clínicos y complicaciones ............................................... 15 1.4.4. Astrovirus ............................................................................................... 15 1.4.4.1 Historia ................................................................................................. 15 1.4.4.2 Biología y taxonomía ........................................................................... 15 1.4.4.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 16 1.4.4.4 Epidemiología ...................................................................................... 17 1.4.4.5 Formas de transmisión ......................................................................... 17 1.4.4.6. Aspectos clínicos y complicaciones .................................................... 18 1.4.5 Adenovirus entéricos ............................................................................... 18 1.4.5.1 Historia ................................................................................................. 18 1.4.5.2 Biología y taxonomía ........................................................................... 18 1.4.5.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 19 1.4.5.4 Epidemiología ...................................................................................... 19 1.4.5.5 Formas de transmisión ......................................................................... 20 1.4.5.6 Aspectos clínicos y complicaciones ..................................................... 20 1.5 Diagnóstico de agentes virales diarreagénicos. .............................................. 20 1.5.1 Técnicas directas: microscopía electrónica, Detección de antígenos por inmunoensayos y aglutinación. ........................................................................ 20 1.5.2 Detección del genoma viral ..................................................................... 20 1.5.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ..................................... 21 1.5.2.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR)21 1.5.2.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa reversa en tiempo real (RT-qPCR) ........ 22 1.5.2.5 Otras técnicas ....................................................................................... 22 2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 24 2.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................ 24 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 24 3. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 25 3.1 Tipo de estudio .......................................................................................... 25 3.2 Área geográfica ......................................................................................... 25 3.3 Universo .................................................................................................... 25 3.4 Población ................................................................................................... 25 3.5 Muestra ...................................................................................................... 25 3.6 Material biológico ..................................................................................... 25 3.7 Procedimientos .......................................................................................... 26 3.7.1 Extracción de ARN viral ......................................................................... 26 3.7.2 Extracción de ADN viral ......................................................................... 26 3.7.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa Transcripción Reversa en Tiempo Real (RT-qPCR) múltiple .... 27 3.7.4 Interpretación de resultados de RT-qPCR ............................................... 29 3.7.5 Secuenciación de cADN de Norovirus .................................................... 29 3.7.5.1 Protocolo de Transcripción Reversa (RT) del ARN de Norovirus GI/GII 30 3.7.5.2 Purificación del producto de PCR .................................................. 31 3.7.5.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) convencional de la región C .. 31 3.7.5.4 Análisis de secuenciación y construcción del árbol filogenético ... 32 3.7.5.5 Protocolo de clonación ................................................................... 32 3.7.5.5.1 Purificación del producto de PCR. ............................................. 33 3.7.5.5.2 Ligación en el vector p-GEM ..................................................... 33 3.7.5.5.3 Transformación. .......................................................................... 34 3.7.6 Extracción del plásmido .......................................................................... 34 3.7.7. Árbol filogenético norovirus .............................................................. 35 3.7.8 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) para la identificación de Rotavirus ................. 36 3.7.8.1 PCR para la identificación y posterior secuenciación de rotavirus ...... 37 3.8 ASPECTOS ÉTICOS ................................................................................ 39 3.9 ANÁLISIS DE DATOS ............................................................................ 39 4. RESULTADOS .................................................................................................. 40 4.1. Datos sociodemográficos y factores de riesgo .............................................. 40 4.2. Estudio viral .................................................................................................. 42 4.2.1. Proporción de agentes virales ................................................................ 42 4.2.2. Detección viral en meses del año entre casos y controles ...................... 43 4.2.3 Detección viral entre casos y controles por rangos de edad y durante los meses de estudio ................ 46 4.2.4 Detección viral en meses del año por sexo entre casos y controles ........ 52 4.2.5 Coinfecciones virales en casos y controles .............................................. 55 4.3 Filogenia de aislados de norovirus GI y norovirus GII ............................. 58 4.4. Filogenia de aislados de rotavirus ................................................................. 62 4.4.1 Comparación del análisis filogenético de las proteína VP4/VP7 de rotavirus 65 4.5 Factores demográficos implicados en EDA de etiología viral ....................... 66 5. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 71 6. CONCLUSIONES ................................................................................................. 77 7. REFERENCIAS ..................................................................................................... 79 8. ANEXOS .............................................................................................................. 100 Ej. 1 application/pdf T 86.16 S162d https://repositorio.udes.edu.co/handle/001/634 spa Bucaramanga : Universidad de Santander, 2016 Facultad Ciencias de la Salud Maestría en Investigación en enfermedades Infecciosas Abdel-Moneim, A. S., Al-Malky, M. I., Alsulaimani, A. A., Abuelsaad, A. S., Mohamed, I., & Ismail, A. K. (2015). Sequence Diversity of VP4 and VP7 Genes of Human Rotavirus Strains in Saudi Arabia. Foodborne Pathog Dis, 12(12), 937-944. doi: 10.1089/fpd.2015.1990 Afrad, M. H., Hassan, Z., Farjana, S., Moni, S., Barua, S., Das, S. K., Rahman, M. (2013). Changing profile of rotavirus genotypes in Bangladesh, 2006-2012. BMC Infect Dis, 13, 320. doi: 10.1186/1471-2334-13-320 Ahmed, S. M., Hall, A. J., Robinson, A. 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J Clin Microbiol, 52(3), 916-923. doi: 10.1128/JCM.02697-13 Elliott, E. J. (2007). Acute gastroenteritis in children. BMJ, 334(7583), 35-40. doi: 10.1136/bmj.39036.406169.80 Farfán, M., Piemonte, P., Labra, Y., Henríquez, J., Candía, E., & Torres, J. P. (2016). Panel Filmarray GI® en la detección de patógenos entéricos en deposiciones: experiencia preliminar. Revista chilena de infectología, 33(1), 89-91. Feeney, S. A., Armstrong, V. J., Mitchell, S. J., Crawford, L., McCaughey, C., & Coyle, P. V. (2011). Development and clinical validation of multiplex TaqMan(R) assays for rapid diagnosis of viral gastroenteritis. J Med Virol, 83(9), 1650-1656. doi: 10.1002/jmv.22162 Kim, J. M., Kim, S. Y., Park, Y. B., Kim, H. J., Min, B. S., Cho, J. C., & Ko, G. (2012). Simultaneous detection of major enteric viruses using a combimatrix microarray. Journal of Microbiology, 50(6), 970-977. Fernández, K. P., Ulloa, J. C., Meneses, M. M., Matiz, L. F., & Gutiérrez, M. F. (2015). Norovirus, the principal cause of viral diarrhea in two regions of Colombia. Universitas Scientiarum, 20(1), 107-115. Derechos Reservados - Universidad de Santander, 2016 info:eu-repo/semantics/openAccess Atribución-NoComercial 4.0 Internacional (CC BY-NC 4.0) https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ Enfermedad diarreica aguda Infecciones virales gastrointestinales Agentes virales Filogenético Detección de agentes virales diarreagénicos en niños menores de cinco años en Bucaramanga y su área metropolitana Trabajo de grado - Maestría http://purl.org/coar/resource_type/c_bdcc Text info:eu-repo/semantics/masterThesis https://purl.org/redcol/resource_type/TM info:eu-repo/semantics/publishedVersion Publication http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 http://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85 |
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Detección de agentes virales diarreagénicos en niños menores de cinco años en Bucaramanga y su área metropolitana |
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Detección de agentes virales diarreagénicos en niños menores de cinco años en Bucaramanga y su área metropolitana Sánchez Álvarez, Nayibe T. Sánchez Álvarez, Nayibe T. Farfán García, Ana Elvira Gómez Duarte, Oscar Gilberto Enfermedad diarreica aguda Infecciones virales gastrointestinales Agentes virales Filogenético TABLA DE CONTENIDO INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1 1. MARCO TEÓRICO ............................................................................................. 1 1.1 Enfermedad Diarreica Aguda ...................................................................... 1 1.2 Carga de la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) a nivel global ................ 1 1.3 Epidemiología de EDA en Colombia .......................................................... 2 1.4 Agentes causantes de EDA .......................................................................... 5 1.4.1 Norovirus - NoV ........................................................................................ 5 1.4.1.1 Historia ................................................................................................... 5 1.4.1.2 Biología y taxonomía ............................................................................. 5 1.4.1.3 Replicación viral o ciclo biológico ................................................... 7 1.4.1.4 Epidemiología .................................................................................. 8 1.4.1.5 Formas de transmisión ...................................................................... 9 1.4.1.6 Aspectos clínicos y complicaciones ....................................................... 9 1.4.2 Rotavirus .................................................................................................. 10 1.4.2.1 Historia ................................................................................................. 10 1.4.2.2 Biología y taxonomía .......................................................................... 10 1.4.2.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 11 1.4.2.4 Epidemiología ...................................................................................... 12 1.4.2.5 Formas de transmisión ......................................................................... 13 1.4.2.6 Aspectos clínicos y complicaciones ..................................................... 13 1.4.3 Sapovirus ................................................................................................. 13 1.4.3.1 Historia ................................................................................................. 13 1.4.3.2 Biología y taxonomía ........................................................................... 13 1.4.3.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 14 1.4.3.4 Epidemiología ...................................................................................... 14 1.4.3.5 Formas de transmisión .................................................................... 15 1.4.3.6 Aspectos clínicos y complicaciones ............................................... 15 1.4.4. Astrovirus ............................................................................................... 15 1.4.4.1 Historia ................................................................................................. 15 1.4.4.2 Biología y taxonomía ........................................................................... 15 1.4.4.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 16 1.4.4.4 Epidemiología ...................................................................................... 17 1.4.4.5 Formas de transmisión ......................................................................... 17 1.4.4.6. Aspectos clínicos y complicaciones .................................................... 18 1.4.5 Adenovirus entéricos ............................................................................... 18 1.4.5.1 Historia ................................................................................................. 18 1.4.5.2 Biología y taxonomía ........................................................................... 18 1.4.5.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 19 1.4.5.4 Epidemiología ...................................................................................... 19 1.4.5.5 Formas de transmisión ......................................................................... 20 1.4.5.6 Aspectos clínicos y complicaciones ..................................................... 20 1.5 Diagnóstico de agentes virales diarreagénicos. .............................................. 20 1.5.1 Técnicas directas: microscopía electrónica, Detección de antígenos por inmunoensayos y aglutinación. ........................................................................ 20 1.5.2 Detección del genoma viral ..................................................................... 20 1.5.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ..................................... 21 1.5.2.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR)21 1.5.2.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa reversa en tiempo real (RT-qPCR) ........ 22 1.5.2.5 Otras técnicas ....................................................................................... 22 2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 24 2.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................ 24 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 24 3. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 25 3.1 Tipo de estudio .......................................................................................... 25 3.2 Área geográfica ......................................................................................... 25 3.3 Universo .................................................................................................... 25 3.4 Población ................................................................................................... 25 3.5 Muestra ...................................................................................................... 25 3.6 Material biológico ..................................................................................... 25 3.7 Procedimientos .......................................................................................... 26 3.7.1 Extracción de ARN viral ......................................................................... 26 3.7.2 Extracción de ADN viral ......................................................................... 26 3.7.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa Transcripción Reversa en Tiempo Real (RT-qPCR) múltiple .... 27 3.7.4 Interpretación de resultados de RT-qPCR ............................................... 29 3.7.5 Secuenciación de cADN de Norovirus .................................................... 29 3.7.5.1 Protocolo de Transcripción Reversa (RT) del ARN de Norovirus GI/GII 30 3.7.5.2 Purificación del producto de PCR .................................................. 31 3.7.5.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) convencional de la región C .. 31 3.7.5.4 Análisis de secuenciación y construcción del árbol filogenético ... 32 3.7.5.5 Protocolo de clonación ................................................................... 32 3.7.5.5.1 Purificación del producto de PCR. ............................................. 33 3.7.5.5.2 Ligación en el vector p-GEM ..................................................... 33 3.7.5.5.3 Transformación. .......................................................................... 34 3.7.6 Extracción del plásmido .......................................................................... 34 3.7.7. Árbol filogenético norovirus .............................................................. 35 3.7.8 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) para la identificación de Rotavirus ................. 36 3.7.8.1 PCR para la identificación y posterior secuenciación de rotavirus ...... 37 3.8 ASPECTOS ÉTICOS ................................................................................ 39 3.9 ANÁLISIS DE DATOS ............................................................................ 39 4. RESULTADOS .................................................................................................. 40 4.1. Datos sociodemográficos y factores de riesgo .............................................. 40 4.2. Estudio viral .................................................................................................. 42 4.2.1. Proporción de agentes virales ................................................................ 42 4.2.2. Detección viral en meses del año entre casos y controles ...................... 43 4.2.3 Detección viral entre casos y controles por rangos de edad y durante los meses de estudio ................ 46 4.2.4 Detección viral en meses del año por sexo entre casos y controles ........ 52 4.2.5 Coinfecciones virales en casos y controles .............................................. 55 4.3 Filogenia de aislados de norovirus GI y norovirus GII ............................. 58 4.4. Filogenia de aislados de rotavirus ................................................................. 62 4.4.1 Comparación del análisis filogenético de las proteína VP4/VP7 de rotavirus 65 4.5 Factores demográficos implicados en EDA de etiología viral ....................... 66 5. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 71 6. CONCLUSIONES ................................................................................................. 77 7. REFERENCIAS ..................................................................................................... 79 8. ANEXOS .............................................................................................................. 100 |
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Sánchez Álvarez, Nayibe T. Sánchez Álvarez, Nayibe T. Farfán García, Ana Elvira Gómez Duarte, Oscar Gilberto |
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Enfermedad diarreica aguda Infecciones virales gastrointestinales Agentes virales Filogenético |
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2016-10-21 |
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Español |
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Bucaramanga : Universidad de Santander, 2016 |
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Trabajo de grado - Maestría |
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Acute diarrheal disease (ADD), the highest prevalence in children under five. It can be caused by bacteria, parasites and / or viruses mainly. The diagnosis of gastrointestinal viral infections is limited by the high costs of molecular techniques and the lack of health personnel about its clinical importance. Reported studies of these infections in Colombia are scarce. Objective: To identify the frequency of viral agents associated EDA phylogenetic level and characterize the two most common viral agents. Materials and Methods: From biological material collected from a previous case-control study of 405 children with EDA and 405 controls, an analytical study. Stool samples were processed by molecular methods for the detection of adenovirus, norovirus, sapovirus, astrovirus and rotavirus. Additionally, direct ELISA was used for the detection of rotavirus antigen. Phylogenetic analysis was performed to norovirus and rotavirus by amplifying target gene fragment C region capsid proteins VP4 and VP7 and respectively. Results: Among the 810 samples positive for the virus was detected in 30,1%, 45,4% in cases and 14,8% in controls. The most prevalent virus norovirus GII was 10,9%, followed by rotavirus and sapovirus with 5,1% each. Adenovirus, astrovirus and norovirus GI were detected in percentages ranging from 1,7 to 3,8%. The highest frequency of virus was observed in the age ranges of 12 to 23 months and 24-59 months. GII Norovirus was the most prevalent in cases with symptoms of diarrhea and vomiting in 93 and 88,8% respectively. The most common norovirus genotypes were GI.2 and GII.4 and the most common rotavirus genotypes were G12P8 and G9P8. Conclusions: 6 virus identification was achieved in stool samples of children under five years. The most frequently isolated viral agent was norovirus and most important subtype was norovirus GII. The importance of virus in the epidemiology of EDA and high genetic diversity of genotypes of norovirus and rotavirus in a pediatric population of Bucaramanga and its metropolitan area, Colombia was demonstrated.
La enfermedad diarreica aguda (EDA), presenta mayor prevalencia en niños menores de cinco años. Puede estar causada por bacterias, parásitos y/o principalmente virus. El diagnóstico de infecciones virales gastrointestinales es limitado por los altos costos en técnicas moleculares y el desconocimiento del personal de salud sobre su importancia clínica. Los estudios reportados de estas infecciones en Colombia son escasos. Objetivo: Identificar la frecuencia de agentes virales asociados a EDA y caracterizar a nivel filogenético los dos agentes virales más frecuentes. Materiales y métodos: A partir del material biológico colectado de un estudio previo de casos y controles de 405 niños con EDA y 405 controles, se realizó un estudio analítico. Las muestras de heces se procesaron por métodos moleculares para la detección de adenovirus, norovirus, sapovirus, astrovirus y rotavirus. Adicionalmente, ELISA directo fue usada para la detección de antígenos de rotavirus. El análisis filogenético fue realizado para norovirus y rotavirus mediante la amplificación de genes blanco de los fragmentos de la región C de la cápside y las proteínas VP4 y VP7, respectivamente. Resultados: Entre las 810 muestras se detectó positividad para virus en 30,1 %, 45,4 % en casos y 14,8 % en controles. El virus más prevalente fue norovirus GII 10,9 %, seguido de rotavirus y sapovirus con 5,1 % cada uno. Adenovirus, astrovirus y norovirus GI se detectaron en porcentajes que variaron entre 1,7 y 3,8 %. La mayor frecuencia de virus se observó en los rangos de edad de 12 a 23 meses y de 24 a 59 meses. Norovirus GII fue el más prevalente en los casos con síntomas de diarrea y vómito en 93 y 88,8 % respectivamente. Los genotipos de norovirus más frecuentes fueron GI.2 y GII.4 y los genotipos más frecuentes de rotavirus fueron G12P8 y G9P8. Conclusiones: Se logró la identificación de 6 virus en muestras de materia fecal de niños menores de cinco años. El agente viral más frecuentemente aislado fue norovirus y el subtipo más importante fue norovirus GII. Se demostró la importancia de los virus en la epidemiología de EDA y la alta diversidad genética de los genotipos de norovirus y rotavirus en una población pediátrica de Bucaramanga y su área metropolitana, Colombia.
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TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1
1. MARCO TEÓRICO ............................................................................................. 1
1.1 Enfermedad Diarreica Aguda ...................................................................... 1
1.2 Carga de la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) a nivel global ................ 1
1.3 Epidemiología de EDA en Colombia .......................................................... 2
1.4 Agentes causantes de EDA .......................................................................... 5
1.4.1 Norovirus - NoV ........................................................................................ 5
1.4.1.1 Historia ................................................................................................... 5
1.4.1.2 Biología y taxonomía ............................................................................. 5
1.4.1.3 Replicación viral o ciclo biológico ................................................... 7
1.4.1.4 Epidemiología .................................................................................. 8
1.4.1.5 Formas de transmisión ...................................................................... 9
1.4.1.6 Aspectos clínicos y complicaciones ....................................................... 9
1.4.2 Rotavirus .................................................................................................. 10
1.4.2.1 Historia ................................................................................................. 10
1.4.2.2 Biología y taxonomía .......................................................................... 10
1.4.2.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 11
1.4.2.4 Epidemiología ...................................................................................... 12
1.4.2.5 Formas de transmisión ......................................................................... 13
1.4.2.6 Aspectos clínicos y complicaciones ..................................................... 13
1.4.3 Sapovirus ................................................................................................. 13
1.4.3.1 Historia ................................................................................................. 13
1.4.3.2 Biología y taxonomía ........................................................................... 13
1.4.3.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 14
1.4.3.4 Epidemiología ...................................................................................... 14
1.4.3.5 Formas de transmisión .................................................................... 15
1.4.3.6 Aspectos clínicos y complicaciones ............................................... 15
1.4.4. Astrovirus ............................................................................................... 15
1.4.4.1 Historia ................................................................................................. 15
1.4.4.2 Biología y taxonomía ........................................................................... 15
1.4.4.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 16
1.4.4.4 Epidemiología ...................................................................................... 17
1.4.4.5 Formas de transmisión ......................................................................... 17
1.4.4.6. Aspectos clínicos y complicaciones .................................................... 18
1.4.5 Adenovirus entéricos ............................................................................... 18
1.4.5.1 Historia ................................................................................................. 18
1.4.5.2 Biología y taxonomía ........................................................................... 18
1.4.5.3 Replicación viral o ciclo biológico ...................................................... 19
1.4.5.4 Epidemiología ...................................................................................... 19
1.4.5.5 Formas de transmisión ......................................................................... 20
1.4.5.6 Aspectos clínicos y complicaciones ..................................................... 20
1.5 Diagnóstico de agentes virales diarreagénicos. .............................................. 20
1.5.1 Técnicas directas: microscopía electrónica, Detección de antígenos por inmunoensayos y aglutinación. ........................................................................ 20
1.5.2 Detección del genoma viral ..................................................................... 20
1.5.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ..................................... 21
1.5.2.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR)21
1.5.2.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa transcriptasa reversa en tiempo real (RT-qPCR) ........ 22 1.5.2.5 Otras técnicas ....................................................................................... 22
2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 24
2.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................ 24
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................... 24
3. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 25
3.1 Tipo de estudio .......................................................................................... 25
3.2 Área geográfica ......................................................................................... 25
3.3 Universo .................................................................................................... 25
3.4 Población ................................................................................................... 25
3.5 Muestra ...................................................................................................... 25
3.6 Material biológico ..................................................................................... 25
3.7 Procedimientos .......................................................................................... 26
3.7.1 Extracción de ARN viral ......................................................................... 26
3.7.2 Extracción de ADN viral ......................................................................... 26
3.7.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa Transcripción Reversa en Tiempo Real (RT-qPCR) múltiple .... 27
3.7.4 Interpretación de resultados de RT-qPCR ............................................... 29
3.7.5 Secuenciación de cADN de Norovirus .................................................... 29
3.7.5.1 Protocolo de Transcripción Reversa (RT) del ARN de Norovirus GI/GII 30
3.7.5.2 Purificación del producto de PCR .................................................. 31
3.7.5.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) convencional de la región C .. 31
3.7.5.4 Análisis de secuenciación y construcción del árbol filogenético ... 32
3.7.5.5 Protocolo de clonación ................................................................... 32
3.7.5.5.1 Purificación del producto de PCR. ............................................. 33
3.7.5.5.2 Ligación en el vector p-GEM ..................................................... 33
3.7.5.5.3 Transformación. .......................................................................... 34
3.7.6 Extracción del plásmido .......................................................................... 34
3.7.7. Árbol filogenético norovirus .............................................................. 35
3.7.8 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) para la identificación de Rotavirus ................. 36
3.7.8.1 PCR para la identificación y posterior secuenciación de rotavirus ...... 37
3.8 ASPECTOS ÉTICOS ................................................................................ 39
3.9 ANÁLISIS DE DATOS ............................................................................ 39
4. RESULTADOS .................................................................................................. 40
4.1. Datos sociodemográficos y factores de riesgo .............................................. 40
4.2. Estudio viral .................................................................................................. 42
4.2.1. Proporción de agentes virales ................................................................ 42
4.2.2. Detección viral en meses del año entre casos y controles ...................... 43
4.2.3 Detección viral entre casos y controles por rangos de edad y durante los meses de estudio ................ 46
4.2.4 Detección viral en meses del año por sexo entre casos y controles ........ 52
4.2.5 Coinfecciones virales en casos y controles .............................................. 55
4.3 Filogenia de aislados de norovirus GI y norovirus GII ............................. 58
4.4. Filogenia de aislados de rotavirus ................................................................. 62
4.4.1 Comparación del análisis filogenético de las proteína VP4/VP7 de rotavirus 65
4.5 Factores demográficos implicados en EDA de etiología viral ....................... 66
5. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 71
6. CONCLUSIONES ................................................................................................. 77
7. REFERENCIAS ..................................................................................................... 79
8. ANEXOS .............................................................................................................. 100 |
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